¿Cómo puedo saber si el ADN clonado y la ligadura de éxito?
Para determinar cómo funciona un gen en una célula mediante la transfección de un gen para sobreexpresar ella, es crítica para asegurar el ácido (ADN) clonación y ligación paso desoxirribonucleico que implica un vector apropiado es exitosa. Si la etapa de ligación no tuvo éxito, o si inserto de ADN no se ha insertado en la orientación correcta, los datos serán interpretables, y será imposible determinar cómo funciona el gen en la célula.
Cosas que necesitará
- cebadores de PCR
- 3 por ciento en gel de agarosa
- plásmido no ligados
- El plásmido más el ADN inserto
- enzimas de restricción apropiadas para inserción especial
- glicerol 4x que contiene tampón de carga
- El bromuro de etidio u otro agente intercalante de ADN
Crear reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cebadores para su inserto que incorpora un nuevo sitio de restricción en el cebador. Por ejemplo, su cebador de PCR es de 18 nucleótidos de largo a la corriente arriba o cinco final primer (5’ ) añadir la secuencia canónica para una enzima de restricción que no está ya dentro del plásmido. Esto permitirá que para la clonación unidireccional del inserto en el plásmido. Las secuencias de sitios de restricción se pueden encontrar en páginas web de empresas que venden las enzimas, tales como Current Protocols in Molecular Biology y New England Biolab, que están vinculados en la sección Recursos.
Determinar el tamaño de los productos PCR. Para ello, ejecute una alícuota del producto de PCR en un gel de agarosa al 3 por ciento, junto con un marcador de peso molecular apropiado. Esto también determina si o no un solo producto se amplificó.
Secuenciar el producto de PCR.
Introduzca secuencia en la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (BLAST, BLASTN) para asegurar que sólo el gen pretendido se amplificó. La herramienta de búsqueda está vinculado en la sección Recursos.
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Se digiere el plásmido además insertar usando las enzimas de restricción apropiadas. Para ello, después de que el producto de PCR ha sido verificada y se ligó en el vector apropiado. Siga las instrucciones para el tiempo de digestión y la temperatura proporcionada con las enzimas.
Ejecutar una alícuota del plásmido restringido diluido en tampón de carga 4x que contiene bromuro de etidio u otro agente intercalante de ADN para visualizar el ADN en un gel de agarosa. Si el inserto se ligó correctamente en el plásmido, dos fragmentos deben ser visibles en el gel.
Secuenciar el inserto para asegurarse de que fue incorporado en la orientación correcta. Hacerlo cortando el plásmido además insertar usando enzimas de restricción que son de aguas arriba y aguas abajo del inserto. cebadores Diseño de secuenciación que incorporan algunos de plásmido y se insertan juntos en el mismo cebador. Esto le dirá definitivamente sobre la inserción y la orientación.