Protocolo maxiprep plásmido
Los científicos usan el protocolo plásmido maxiprep cuando necesitan para extraer grandes cantidades de ADN plasmídico a partir de un cultivo celular. De hecho, la única diferencia principal entre los protocolos de minipreparación, Midiprep y maxiprep es la cantidad de cultivo de células utilizado y por lo tanto el plásmido de ADN total cedió. Con arreglo al Protocolo maxiprep Promega, hay tres pasos esenciales.
Cultivo de células
Transformada, o que contiene el plásmido, la bacteria E. coli se cultivan en una placa de agar y se utiliza para inocular 100 a 200 ml de medio Luria-Bertani (LB) caldo. El cultivo se coloca entonces en un plato agitador en un incubador Celsius 37 grados y se dejó crecer durante 12 a 21 horas. volumen celular óptimo se alcanza a las 12 a 16 horas.
La lisis celular
El cultivo bacteriano se sedimenta usando una centrífuga y el sobrenadante o caldo se puede extraer. Una solución de hidróxido de sodio y dodecil sulfato de sodio (SDS) se añade al sedimento para inducir la lisis celular. Debido al gran volumen de las células, se debe tener cuidado para asegurarse de que el sedimento celular se resuspende completamente en solución. De lo contrario, no todas las células se lisan y el potencial de rendimiento de plásmido de ADN se ve afectada seriamente.
Extracción de ADN
Extracción de ADN de plásmido utiliza una solución alcalina, en este caso el hidróxido de sodio, para desnaturalizar genómico (bacteriana) de ADN y el plásmido de ADN. Cuando la solución se lleva de nuevo a un pH neutro, el plásmido de ser mucho más pequeño que el ADN genómico de ADN es capaz de re-recocido. El ADN genómico se precipita de la solución durante la centrifugación o extracción columna de vacío dejando ADN plásmido relativamente puro en la suspensión o unida a la columna.